Salutare! Mă tot întreb dacă cineva a mai lucrat cu enzime de restricție în contextul geneticii, mai ales în proiecte de editare genetică sau clonare. Sincer, nu știu dacă doar mie mi se pare complicat să le aleg corect pentru anumite secvențe sau dacă e normal să te lovești de tot felul de probleme legate de site-uri de tăiere, receptori etc.
Tocmai am terminat o parte din bagajul teoretic pentru lucrare și, deși am înțeles conceptul, aplicarea practică e o altă poveste. În bibliografie, tot găsesc explicații generale, dar nu exemplifică prea bine în cazuri concrete. Vreau să fiu sigur că înțeleg bine ac ea aspecte, mai ales când e vorba de combinații între enzime sau de optimizarea condițiilor de reacție.
Pe voi v-a ajutat în vreun fel să înțelegeți mai clar aplicabilitatea lor sau ați avut momente de frustrare? Orice părere, experiență sau recomandare ar fi super binevenite, ca să nu rămân blocat pe partea practică. Mersi mult!
Salutare, Gelu! Înțeleg perfect frustrarea legată de alegerea și aplicarea enzimelor de restricție, e o senzație comună la început. La mine, cel mai mult m-a ajutat să pun pe hârtie planul exact al experimentului și să folosesc software-uri specializate sau chiar site-uri dedicate pentru a verifica compatibilitatea enzimelor și secvenței target.
De exemplu, când trebuie să aleg o enzimă, și să fiu sigură că nu va avea site-uri de tăiere în afara regiunii de interes, îmi verific secvența în primer design tools sau în NEBcutter - e simplu și rapid, și îți dă o perspectivă clară asupra posibilelor fragmente.
Pe de altă parte, pentru combinații de enzime, e important să acorzi atenție restricțiilor de mărire, compatibilității temperaturilor și a co-factorilor. Și, dacă ai timp, testarea în laborator cu enzimă în condiții diferite poate salva multe bătăi de cap, dacă nu ești sigur pe teoria ta.
Mi s-a întâmplat și mie să fiu blocată la început, dar odată ce am înțeles logica din spatele fiecărei alegeri și am făcut gym cu exemple concrete, a devenit mai fluid. Deci, pentru a nu te strica, recomand să pui accent și pe partea practică, chiar dacă uneori te lovești de experimente nereușite. Oricând vrei să discutăm un caz concret sau un anumit set de enzime, sunt aici!
Baftă și să nu te lași, e o provocare, dar și o satisfacție câștigată când reușești să planifici totul impecabil!
Salutare, Adriana și Gelu!
Mă bucur să văd că discuția e atât de relevantă și plină de idei utile. În ceea ce mă privește, eu am avut și eu momente de dificultate la început, mai ales când încercam să combin mai multe enzime pentru un experiment de cloning complex. La început, nu m-am horrorat, ci am încercat să înțeleg cât mai bine mecanismul fiecărei enzime în parte, mai ales restricțiile lor.
Ce m-a ajutat sincer a fost să folosesc și eu diferite soft-uri, dar mai ales să exersez mult în laborator, chiar și cu enzime pe secvențe mici, ca să văd efectul în practică. Pentru mine, cel mai mult a contat să înțeleg cum se comportă enzimele în condiții diferite, cum afectează temperatura, pH-ul, dar și compatibilitatea între ele dacă le combin.
De exemplu, când trebuia să aleg enzime pentru un clonaj cu multiple site-uri de tăiere, mi-am făcut o listă cu enzime compatibile între ele și cu secvența mea de interes și apoi am verificat totul în NEB Cutter sau în Genome Builder. O chestie importantă pe care am învățat-o e să nu ne bazăm doar pe teorie, ci să verificăm totul în practică, chiar dacă implică câteva experimente de test.
Un alt pont de care am ținut cont e să pregătesc tot protocolul înainte de a începe, cu toate reactivii și condițiile pentru fiecare etapă, ca să reduc greșelile în reaction.
Așadar, pe lângă teoria din bibliografie și software-uri, părerea mea e să nu subestimezi experiența din laborator și să încerci, dacă poți, și combinații și condiții diferite. În final, cred că învățăm cu toții mai bine din greșeli și din experiența directă.
Hai să ne mai povestim și despre cazuri concrete dacă vrei, ca să ne ajutăm reciproc! Succes și multă răbdare!
Salutare tuturor!
Vă mulțumesc pentru răspunsuri, chiar mi-au fost de ajutor și mă simt mai încrezător în planurile mele. Într-adevăr, combinația de teorie, software și practică mi se pare cea mai eficientă abordare. Mi-aș dori și eu să pot testa mai mult în laborator, dar momentan încerc să compilez cât mai multe informații și cazuri concrete pentru a nu mai lua decizii la întâmplare.
Un aspect despre care am observat că mai dă bătăi de cap e atunci când secvența de interes are, să zicem, site-uri de tăiere similare sau foarte apropiate, ceea ce face dificilă selectarea enzimei ideale fără să afectezi alte zone. Până acum, cel mai mult m-a ajutat să verific manual fie în NEBcutter, fie în ApE plasmid editor, modelând diferite scenarii, ca să reduc riscul de tăieturi nedorite.
De asemenea, încerc să-mi structurez în notițe toate restricțiile și compatibilitățile, pentru a avea un ghid rapid pe măsură ce avansez cu proiectul. Și da, și eu cred că experiența în laborator joacă un rol crucial, chiar dacă uneori înseamnă să pierzi niște enzime sau timp, dar învățăm din greșeli, cum spunea și Adrian.
De la voi mai aștept exemple concrete sau sfaturi despre enzimelor preferate pentru anumite tipuri de secvențe. În final, chiar dacă e complicat, e o provocare care merită, mai ales când vezi rezultatele muncii tale.
Mulțumesc încă o dată și succes tuturor!
Adrian Ionescu
Salutare tuturor!
Mă bucur să văd că tot discutăm despre un subiect atât de complex, dar și de relevant pentru toți cei implicați în domeniu. Vreau să adaug câteva experiențe și idei personale care, poate, vor mai lumina anumite aspecte.
În primul rând, pentru alegerea enzimei, eu recomand întotdeauna să verific nu doar site-urile de tăiere, ci și să consult și literatura de specialitate sau fișele tehnice ale enzimei respective, pentru a înțelege mai bine specificul ei. Uneori, combinarea informațiilor te poate ajuta să previi probleme, mai ales dacă ești pe cale să faci multiplex sau să folosești enzime cu restricții speciale.
De asemenea, cu privire la condițiile de reacție - pH-ul și temperatura sunt cruciale. În experimentele mele, de multe ori reușeam să optimizez condițiile pentru o enzimă fie ajustând pH-ul, fie încercând diferite temperaturi, dar mereu verificând eficiența înainte de a merge mai departe în protocolul final.
Un sfat practic: dacă aveți posibilitatea, testați în condiții mici, pe o cantitate redusă de reacție. Astfel, puteți varia condițiile fără a pierde mult reactiv și veți obține o idee foarte clară despre ce funcționează și ce nu.
În plus, pentru combinații multiple, mă bazez foarte mult pe verificări în soft-uri precum NEBcutter sau FastDigest, dar întotdeauna păstrez marginea de siguranță verificând manual secvența, mai ales dacă există secvențe repetate sau apropiate, pentru a evita tăieturi nedorite.
O altă tehnică utilă e și folosirea enzimelor cu site-uri de tăiere diferite, dar compatibile între ele (recomandată în special pentru clonajele complexe), astfel încât să obțin fragmente ușor de manipulat și de inserat.
Eh, în final, cred că e foarte important să nu ne temem să experimentăm și să învățăm din greșeli - experiența în laborator e cea mai bună școală.
Voi continua să pun notițe și exemple concrete, și dacă vreți, putem face și un schimb mai detaliat pe anumite secvențe sau enzime specifice. Succes tuturor și să avem răbdare, pentru că rezultatele merită tot efortul!