A mai pățit cineva să fie o provocare PCR-ul cu ADN-ul? Sincer, am tot citit stuff-ul ăla despre sens și limite, dar când am trecut la experimentele proprii mă trezesc cu tot felul de probleme. Mă lupt cu calitatea ADN-ului extraționat, uneori pare să fie ok, alteori face probleme la amplificare… și nu prea reușesc să înțeleg dacă problema e în reactivi, pe care-i schimb mereu, sau dacă e ceva în protocolul de purificare.
De când am început să-ți punet focus pe partea asta, mă gândesc dacă nu e chiar o provocare mai mult de tehnică decât de teoria în sine, deși mi-ar plăcea să fiu sigur că e de la protocol sau de la reactiv, ca să nu mai pierd timp încercând să modific câte ceva fără efect.
Voi ați avut vreodată momente în care PCR-ul vostru părea "răzvrătit" și v-a dat bătăi de cap? Cum ați reușit să depistați dacă e nevoie de mai multă atenție la ADN sau la procedură? Mă simt un pic descurajat, dar totuși e un pas normal în proces, sau cel puțin așa sper…
Salut, Daniel! Înțeleg perfect sentimentul, și chiar e normal să te simți uneori frustat când lucrurile nu merg ca pe roate, mai ales cu PCR-ul care pare că are propria lui personalitate.
Din experiența mea, primul lucru pe care îl verific e calitatea și puritatea ADN-ului. Mi s-a întâmplat să am rezultate inconsistente atunci când extracția nu a fost făcută corespunzător sau dacă ADN-ul e prea degrabă într-un mediu cu inhibitori. Înainte de orice, mă asigur că am o purificare cât mai curată, chiar dacă asta înseamnă să revizuiesc protocolul, eventual să fac și o reducere a concentrației de reactivi sau să testez cu un alt lot de reactivi pentru a exclude variabilele.
Un alt sfat ar fi să faci controlul calității ADN-ului prin gel electroforeză, ca să vezi dacă fragmentele sunt intacte și de dimensiune corectă. Dacă ADN-ul arată bine, atunci te orientezi spre protocol. În cazul în care problema persistă, eu recomand să ajustezi concentrația de primers sau să verifici temperaturele de annealing; uneori, mici ajustări pot face diferența.
Și, desigur, nu în ultimul rând: verifică dacă termociclatorul tău funcționează conform specificațiilor, căci un aparat cu temperatură instabilă poate da bătăi de cap serioase.
În concluzie, e un proces de încercare și erori, dar e un pas natural în învățare. Cu răbdare și atitudine de investigator, sigur vei trece peste provocări. În cazul meu, uneori am preferat să încep cu o reacție control și să adaug apoi mici variabile, până am găsit condițiile optime. Succes și nu te descuraja, toți am trecut pe acolo! Dacă vrei, putem să discutăm mai în amănunt despre protocolul tău sau să vedem ce alte soluții am putea găsi.