Salutare tuturor! A mai pățit cineva să lucreze cu PCR și analiza ADN-ului și să se simtă cumva blocat de anumite aspecte tehnice sau interpretative?
Sincer, după ce am tot citit și m-am chinuit să reproduc niște experimente, încep să mă întreb dacă nu cumva "rulează" și alte metode sau tehnologii care să fie mai eficiente sau mai adaptate pentru anumite tipuri de probe.
Lucrez de ceva vreme cu PCR clasic și suspectez că uneori nu e chiar suficient, mai ales când vorbim de probe cu cantități foarte mici de ADN sau de fragmente mai deteriorate. Mă întreb dacă nu cumva există tehnici mai moderne, poate ceva real-time PCR sau chiar metode alternative ca secvențierea, care s-ar putea aplica în cercetare sau chiar în laboratorul clinic.
Mă lupt cu partea asta de câteva zile și mă tot gândesc dacă nu cumva e o problemă de setup, de reacționare sau poate chiar de echipamente. Cineva mai are experiență cu chestii din astea și poate să-mi spună dacă "cineva mai rulează" cu alte tehnici, sau dacă e încă la stadiul de a încerca și exersa metoadele mai moderne?
Sincer, mi-ar fi de ajutor și câteva recomandări, idei sau chiar povești din experiențele voastre. Mulțumesc anticipat!
Salut, Stelian! Îți împărtășesc și eu din experiența mea, fiindcă am avut și eu de-a face cu anumite provocări similare. Într-adevăr, PCR-ul clasic are limite atunci când ne confruntăm cu probe degradate sau cu cantități infime de ADN. La un moment dat, am trecut la metode mai moderne pentru a obține rezultate mai precise și rapide.
În primul rând, tehnologia de qPCR (real-time PCR) a fost un pas important pentru mine. Ea îmi oferă posibilitatea nu doar de a amplifica, ci și de a cuantifica ADN-ul în timpul reacției, ceea ce face analiza mult mai sensibilă și mai precisă. În plus, utilizarea coloranților specifici sau a sondei TaqMan a ajutat la reducerea rezultatelor fals pozitive.
Pe de altă parte, dacă vorbim de probe foarte deteriorate sau cu cantități extrem de mici, secvențierea ADN-ului poate fi o soluție. Metodele de secvențiere, mai ales cele NGS (Next-Generation Sequencing), permit identificarea precisă chiar și a fragmentelor minuscule sau fragmentate, dar necesită un setup mai sofisticat și resurse mai mari.
Un alt aspect pe care îl consider important e optimizarea protocolului de extracție, pentru că de multe ori calitatea ADN-ului e cea care face diferența. În cazul probelor de calitate slabă, metodele de amplificare pe baze de amprente sau tehnici precum digital PCR pot fi de mare ajutor, fiind mai sensibile decât PCR-ul clasic.
Pentru început, recomand să verifici dacă setup-ul tău e configurat corect pentru qPCR, dacă reacțiile se face la temperaturi și timp corect, și dacă enzymele folosite sunt de ultimă generație. Dacă ai acces, ar fi benefic să încerci și compararea rezultatelor cu aceste tehnici mai avansate, chiar și pe probe pilot.
Sper că îți pot fi utile aceste sugestii și, dacă vrei, pot să-ți trimit și câteva linkuri sau resurse cu protocoluri și recomandări pentru tehnologiile pe care le-am folosit eu cu succes. Oricum, e clar că lumea cercetării și a diagnosticării evoluează rapid, iar adaptarea la noile tehnologii e esențială pentru rezultate de calitate!